ZAJECIA KOMPUTEROWE 3, inżynieria bioreaktorów laboratorium
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->Laboratorium z Inżynierii bioreaktorówZajęcia komputerowe-„Wyznaczanie parametrów kinetycznych równaniaMichaelis’a-Menten metodą regresji liniowej i nieliniowej”Grupa 15, śr 8:15Magdalena Ciesielska Nr 193237Hubert Kasprowski Nr 193329I.Wstęp teoretyczny:Jeżeli w mieszaninie reakcyjnej stężenie enzymu jest stałe, a stężenie początkowe substratu jest wszerokich granicach zmienne oraz wykonując pomiary dla warunków początkowych reakcji, gdzie niewystępuje akumulacja produktu, to zmiany początkowej szybkości reakcji, wyrażone jako ilośdsubstratu przetworzonego w jednostce czasu można przedstawid w postaci krzywej. Pokazuje tohiperboliczną zależnośd szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu. Krzywa w pewnym punkciezagina się i osiąga stałą wartośd maksymalną *1+. Zakładając dodatkowo istnienie kompleksu enzym-substrat oraz występowanie stanu stacjonarnego (kiedy szybkośd tworzenia i rozpadu kompleksuenzym-substrat są sobie równe) można przedstawid ową zależnośd w postaci równania kinetycznegoMichaelis’a-Menten, które wygląda następująco:(I)W owym równaniu bardzo ważne role spełniają parametryi. Wartośdujawnia liczbęobrotów enzymów, czyli liczbę cząsteczek substratu przekształconych w produkt w jednostce czasu ijest ona zależna od całkowitego stężenia enzymu w roztworze, a także od stałej szybkości reakcjitworzenia produktu z kompleksu enzym-substrat. Stałajest interesująca z następującychpowodów: jest miarą powinowacwa substratu do enzymu, odpowiada wartości stężenia substratupotrzebnego do uzyskania połowy prędkości maksymalnej reakcji enzymatycznej, ustala w przybliżeniuwewnątrzkomórkowe stężenie substratu *2+.W analizie biochemicznej jak i przemysłowej (w celu zastosowania enzymu do procesuprzemysłowego) w oznaczaniu aktywności enzymu jedną z ważniejszych procedur jest określeniewartości jego parametrów kinetycznych. Można to zrobid metodami regresji liniowej i regresjinieliniowej. W skrócie, regresja liniowa polega na dopasowaniu funkcji liniowejdo zbiorupunktów stanowiących dane pomiarowe poprzez minimalizację sumy kwadratów reszt. Nazywa się tokrótko liniową metodą najmniejszych kwadratów *3+. Inaczej mówiąc, poszukuje się takiej linii prostej,aby suma kwadratów odchyleo pomiarów od tej prostej była jak najmniejsza *4+. Aby wykorzystad tęmetodę należy wykonad przekształcenie równania Michaelis’a-Menten (I) aby posiadało ono liniowązaleznośd. Są różne metody linearyzacji, z czego najczęściej stosuje się trzy: Lineweaver’a-Burke’a,Hanes’a-Woolf’a i Woolf’a-Augustinsson-Hofstee *1+. Metoda Lineweaver’a-Burke’a jest jedną znajlepszych metod, która dodatkowo w widoczny sposób ukazuje różne typy inhibicji. Poprzekształceniu równania Michaelis’a-Menten daje następujące równanie:(II)które jestde factofunkcją liniową gdzie na osi rzędnych znajdują się wartości , a na osi odciętych .W pewnych wypadkachlepszym jest stosowanie linearyzacji Hanes’a-Woolf’a, która dajedokładniejsze wyniki *4+. Stosowanie każdej z linearyzacji ma inne uzasadnienie. Posiadając pewnąwiedzę oraz przydatne oprogramowanie, można wykonad wyznaczenie owych parametrówkinetycznych metodą regresji nieliniowej, polegająca na minimalizacji sumy kwadratów reszt dodopasowania funkcji, która nie wykazuje liniowej kombinacji parametrów dopasowania [3]. Funkcjataka w przestrzeni parametrów może mied więcej minimów, które mogą mied równą lub różnągłębokośd. W metodzie tej zależy na wyznaczeniu minimum globalnego co odbywa się metodaminumerycznymi. Zwykle należy podad pewien wyjściowy zestaw parametrów, która są nieodległe odrzeczywistych aby takie minimum zostało odnalezione przez algorytm. Realizacja takiego algorytmuwymaga zastosowania komputera [3].1Nieliniową metodą najmniejszych kwadratów można oznaczyd parametry kinetyczne nie wykonującprzekształceo równania Michaelis’a-Menten. Powyższe metody znajdują szerokie zastosowanie wanalizie biochemicznej, której celem jest bardzo dokładne oznaczenie parametrów enzymów. Dla tegotypu analiz dobiera się inne założenia, inne warunki reakcji niż w analityce przemysłowej. Dodatkowometody analityczne są bardziej subtelne.Kolejnym sposobem wyznaczania parametrów kinetycznych enzymu jest zastosowanie całkowejpostaci równania Michaelis’a-Menten, które prezentuje się w następujący sposób:(())(III)Stosowanie tego równania pozwala na obliczenie parametrów równania kinetycznego metodą regresjinieliniowej *5+. Wyniki wyliczone tym sposobem nie są tak dokładne jak te pochodzące z analizybiochemicznej, aczkolwiek ma to swoje uzasadnienie w przemyśle. Przede wszystkim stosowaniewyników uzyskanych na drodze biochemicznych analiz nie znajdują zastosowania w większej skaliprodukcyjnej podczas prowadzenia procesów w reaktorach, głównie ze względu na mniej subtelnewarunki występujące w tego typu aparatach (zamiast buforów stosowanych w biochemii, w reaktorzewystępują np. NaOH, HCl w celu wyrównania pH procesu, znajduje się tam dużo inhibitorów, asubstancje takie różnie oddziałują na enzym). W przemyśle pobiera się jedynie próbki korygujące,analityka nie jest tak złożona jak dla wcześniejszego przypadku. Również założenia dla przemysłu nie sątakie same jak dla analiz biochemicznych. Między innymi nie zakłada się początkowych warunkówreakcji, przed znaczną akumulacją produktu *6+. Parametry wyznaczane metodą przemysłową sąrównież po to, aby policzyd model reaktora. Liczy się czas przebywania danego substratu w reaktorze,który nie jest obojętny ide factoto od niego zależy stopieo przereagowania i dalszy los produktu narynku. Za pomocą równania (III) można wyznaczyd taki czas modelowy, który następnie porównuje sięz czasem eksperymentalnym. Pokrywanie się wykresów pokazuje, że obliczenia dla reaktora są trafne idobrze odwzorowują procesy mające miejsce w aparacie. Brak pokrycia owych wykresów wskazuje naopory reakcji (np. inhibicję enzymów).Weryfikację taką prowadzi się zwykle w reaktorach okresowych. Aparaty takie, zwłaszcza zwyposażeniem w mieszanie są najdogodniejsze do prowadzenia procesów katalizowanych przezenzymy w fazie ciekłej. Mieszanie pomaga w rozpuszczaniu enzymów na początku procesu *7+. Jest onrównież bardzo często stosowany w praktyce laboratoryjnej jak również w wielu technologiachprzemysłowych *5+. Pracuje on w cyklach, które polegają na początkowym napełnieniu bioreaktorasubstratem, właściwej pracy reaktora, następnie usunięciu zawartości bioreaktora po czym produktpoddaje się dalszej obróbce a bioreaktor jest przywracany do stanu początkowego (co nazywane jestczasem jałowym). Reaktor okresowy jest układem zamkniętym, ponieważ w czasie jego pracy niedopływa do niego ani nie odpływa z niego żaden strumieo substratu czy produktu *5+. Szybkośd reakcjiw bioreaktorze okresowym jest zależna od stężenia substratu, a zatem maleje ona wraz upływemczasu reakcji. Na początku jest ona wysoka, po czym jej wartośd obniża się wraz z obniżeniem ilościsubstratu w objętości reaktora.II.Rozpatrzenie przypadków reakcji enzymatycznej metodą biochemiczną oraz przemysłową:Przed przystąpieniem do analizy podanych metod, warto słowem wstępu zaznaczyd, iż stężeniepoczątkowe dla każdego rozpatrywanego przypadku wynosi21. PODSTAWOWA REAKCJA ENZYMATYCZNAA. Obliczenie wartości Kmi Vmaxmetodą regresji liniowej:Posiadając eksperymentalne dane z pomiarów zależności szybkości reakcji od stężenia substratuprowadzonej w warunkach początkowych reakcji (zanim nastąpi akumulacja produktu reakcji) możnawykonad wykres przedstawiający tę zależnośd.Tabela 1.Funkcja szybkości reakcjiw zależności od stężenia substratuCsr1/Cs1/r0,100,02110,046,70,200,0385,026,70,300,0503,320,00,500,0682,014,70,750,0831,312,01,000,0941,010,71,500,1070,79,32,000,1150,58,72,500,1210,48,33,000,1250,38,04,000,1300,37,75,000,1340,27,57,500,1390,17,210,000,1420,17,115,000,1440,16,920,000,1460,16,925,000,1460,06,80,1600,1400,1200,1000,0800,0600,0400,020r0,0000,005,0010,0015,00Cs20,0025,0030,00Wykres 1.Wykres zależności szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu.3Wykres nr 1 przedstawia nam hiperboliczną zależnośd szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu.Szybkośd reakcji zwiększa się wraz z wyższym stężeniem do pewnego momentu, w którym osiąga onamaksimum. Aby wyznaczyd parametry równania kinetycznego, należy wykonad linearyzację np.Lineweaver’a-Burke’a. W tym celu należy przekształcid równanie Michaelis’a-Menten i zastosowad jegoodwrotnośd.50,045,040,0y = 4x + 6,666735,030,01/r25,020,015,010,05,00,00,02,04,06,01/Cs8,010,012,0Wykres 2.Wykres Lineweaver’a-Burke’a.Równanie przedstawione na wykresie ma postad:Mając odpowiednie dane z wykresu, można wyznaczyd parametry równania:B. Wyznaczenie parametrów kinetycznych metodą regresji nieliniowej:Aby wyznaczyd parametry równania kinetycznego, nie trzeba wykonywad linearyzacji zależnościhiperbolicznej przedstawionej wcześniej. Mając pewną wiedzę o metodzie oraz odpowiednieoprogramowanie można owe elementy kinetyki Michaelis’a-Menten wyznaczyd sposobem regresjinieliniowej:a) Z wykorzystaniem równania Michaelis’a – Menten (metoda „biochemiczna”)4 [ Pobierz całość w formacie PDF ]