Zastosowanie metod elektroforetycznych, Publikacje naukowe
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
ELEKTROFOREZA
PRZYKŁADY ZASTOSOWAŃ
Opracowanie zbiorowe pod redakcją
Bogdana Walkowiaka i Violetty Kochmańskiej
SPIS TREŚCI
O
BJAŚNIENIA SKRìTìW UŻYWANYCH W OPRACOWANIU
.....................................................................
3
W
STĘP
...............................................................................................................................................................
5
E
LEKTROFOREZA JAKO TECHNIKA SEPARACJI MAKROCZĄSTECZEK
Î
Walkowiak B.........................
6
- P
ODSTAWY TEORETYCZNE
................................................................................................................................
7
- R
ODZAJE NOŚNIKìW ELEKTROFORETYCZNYCH
...............................................................................................
10
- R
ODZAJE KOMìR ELEKTROFORETYCZNYCH
....................................................................................................
12
- R
ODZAJE ELEKTROFOREZY
.............................................................................................................................
13
- P
RZYGOTOWANIE PRìBEK DO ELEKTROFOREZY
..............................................................................................
18
-
B
ARWIENIE
,
DOKUMENTACJA ORAZ ANALIZA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA
........................................................
20
1
-
ANTYTRYPSYNY
Î Piłacik B................................................................................
52
7. E
LEKTROFORETYCZNE ROZDZIAŁY BIAŁEK GENERATYWNYCH CZĘŚCI ROŚLIN
Î Kalinowski A.,
Radłowski M..............................................................................................................................................
55
8. K
RZYWE MIARECZKOWANIA ELEKTROFORETYCZNEGO
Î Buchowiecka A., Peltre G................................
61
9. M
INIATUROWA ELEKTROFOREZA DWUKIERUNKOWA
(m2D)
BIAŁEK Z GENERATYWNYCH
CZĘŚCI ROŚLIN
Î Kalinowski A., Radłowski M.........................................................................................
68
10. Z
ASTOSOWANIE ELEKTROFOREZY DWUKIERUNKOWEJ W ANALIZIE BIAŁEK KOMìREK
MDCK
ZAKAŻONYCH WIRUSEM INFLUENZY KONI
Î Rożek W................................................................................
75
11. A
NALIZA PROFILU BIAŁKOWEGO KOMìREK ŚRìDBŁONKA ZA POMOCĄ ELEKTROFOREZY
DWUKIERUNKOWEJ Z UŻYCIEM SYSTEMU
E
TTAN
D
ALT
Î Pawłowska Z......................................................
81
12. E
FEKTYWNOŚĆ TRANSFERU BIAŁEK Z ŻELU POLIAKRYLAMIDOWEGO PRZY POMOCY TECHNIKI
TRANSFERU PìŁSUCHEGO
Î Walkowiak B., Walkowiak A........................................................................
84
13. I
MMUNOBLOTING BIAŁEK MIĘSA
Î
Greaser ML., Pospiech E., Fritz J., Swartz DR..................................
90
14. A
NALIZA GENETYCZNA RODZIN OBCIĄŻONYCH ZESPOŁEM
MEN 2A Î
WYKRYWANIE
GERMINALNYCH MUTACJI PROTOONKOGENU
RET
METODĄ
PCR-SSCP Î
Bartkowiak J., Rieske P.,
Piaskowski S.............................................................................................................................................
94
15. D
IAGNOSTYKA WIRUSA CHOROBY PĘCHERZYKOWEJ ŚWIŃ
(SVD)
Î Niedbalski W., Kęsy A.....................
98
16. E
LEKTROFORETYCZNE OCZYSZCZANIE BIAŁEK Z NADEKSPRESJI W KOMìRKACH
E.Coli
- Szalata M.,
Kalak R., Lipiński D., Pławski A., Słomski R..........................................................................................
101
17. F
RAKCJONOWANIE W ŻELU POLIAKRYLOAMIDOWYM I DETEKCJA FLUORESCENCJI FRAGMENTìW
DNA
ZAWIERAJĄCYCH POWTìRZENIA MINISATELITARNE
Î Słomski R., Kowalska K., Słomska K., Jura J.,
Szalata M.................................................................................................................................................
106
18. B
EZPOŚREDNIE SEKWENCJONOWANIE PRODUKTU
PCR
Z ZASTOSOWANIEM STARTERìW
ZNAKOWANYCH INDODIKARBOCYJANINO
(C
Y
5)
FOSFOROAMIDEM
- Pławski A., Lipiński D.,
Kala M., Słomski R.................................................................................................................................
112
19. A
NALIZA SEKWENCJI
DNA
METODĄ IZOTERMICZNĄ KLONìW WYSELEKCJONOWANYCH Z BIBLIOTEKI
C
DNA
ŁUBINU ŻìŁTEGO
Î Nuc K., Słomski R........................................................................................
116
20. W
YKRYWANIE MUTACJI PUNKTOWYCH W GENIE SUPRESOROWYM
APC
CZŁOWIEKA METODĄ
HETERODUPLEKSìW
Î Pławski A., Lipiński M., Słomski R.....................................................................
119
2
P
RZYKŁADY ZASTOSOWAŃ
........................................................................................................................
23
1. D
ETEKCJA FOSFORYLACJI BIAŁEK POWIERZCHNIOWYCH BŁON KOMìREK ŚRìDBŁONKA
Z UDZIAŁEM EKTOKINAZ BIAŁKOWYCH
Î
Pawłowska Z. .........................................................................
25
2. F
OSFORYLACJA BIAŁEK W PŁYTKACH KRWI STYMULOWANYCH KOLAGENEM
C Kralisz U........................
29
3. O
CENA POZIOMU FOSFORYLACJI BIAŁEK PŁYTEK KRWI AKTYWOWANYCH
ADP
U CHORYCH
Z PRZEWLEKŁĄ NIEWYDOLNOŚCIĄ NEREK
Î Walkowiak B., Tański W., Koziołkiewicz W.......................
35
4. R
OZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY BIAŁEK MIĘSA PRZY UŻYCIU
SDS-PAGE Z
DODATKIEM
8M
MOCZNIKA
Î Greaser ML., Pospiech E., Fritz J., Swartz DR., Grześ B. ...........................................
43
5. E
LEKTROFOREZA BIAŁEK MIĘSA O MASIE POWYŻEJ
200 K
W ŻELU AGAROZOWYM
Î Greaser ML.,
Kumazawa Y., Pospiech E. ......................................................................................................................
48
6. O
CENA FENOTYPìW
OBJAŚNIENIA SKRìTìW UŻYWANYCH W OPRACOWANIU
1D Î symboliczne oznaczenie pierwszego kierunku w elektroforezie
dwuwymiarowej
2D Î symboliczne oznaczenie elektroforezy dwuwymiarowej (dwukierunkowej)
4G10 Î przeciwciało monoklonalne rozpoznające ufosforylowaną formę tyrozyny
125
I Î izotop jodu o masie atomowej 125
131
I Î izotop jodu o masie atomowej 131
14
C Î izotop węgla o masie atomowej 14
3
H Î izotop wodoru o masie atomowej 3 (tryt)
32
P Î izotop fosforu o masie atomowej 32
35
S Î izotop siarki o masie atomowej 35
9D10 Î przeciwciało monoklonalne anty-titina (supernatant komrkowy)
A Î symbol nukleotydu
a
denozyny
ACD Î antykoagulant w skład ktrego wchodzą: kwas cytrynowy, cytrynian sodowy i
cukier glukoza, nazwa zwyczajowa: (
ang.
a
cid
c
itrate
d
extrose
)
ADP Î nukleotyd dwufosforan adenozyny
AMP Î nukleotyd monofosforan adenozyny
ATP Î nukleotyd trjfosforan adenozyny
BSA Î albumina wołowa (
ang.
b
ovine
s
erum
a
lbumin
)
bp Î oznaczenie liczby par zasad DNA (
ang.
b
ase
p
air
)
C Î symbol nukleotydu
c
ytozyny
C Î procentowy udział bis-akrylamidu w całkowitej ilości akrylamidu
CAPS Î 3-[cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid
cDNA Î jednoniciowa postać DNA, będąca kopią RNA, uzyskana w wyniku działania
odwrotnej transkryptazy
CHAPS Î 3-(3-cholamidopropyl) dimethylammonio-1-propane sulfonate
DATD Î N,N
Ó
- diallyltartardiamide
DMEM Î medium hodowli komrkowej
DNA Î kwas deoksyrybonukleinowy
DTT Î 1,4-
d
i
t
io
t
reitol
EDTA Î kwas etylenodiaminotetraoctowy (wersenian dwusodowy) (
ang.
e
thylene
d
iamine
t
etraacetic
a
cid
)
dpi Î jednostka rozdzielczości optycznej skanera (
ang.
d
ot
p
er
i
nch
)
FBS Î wołowa surowica płodowa (
ang.
f
etal
b
ovine
s
erum
)
Fc Î fragment cząsteczki immunoglobuliny nie zawierający miejsc rozpoznających
antygen
FCS Î cielęca surowica płodowa (
ang.
f
etal
c
alf
s
erum
)
G Î symbol nukleotydu
g
uaniny
HAT Î dodatek do medium hodowli komrkowej (
ang.
h
ypoxantine,
a
minophterin
and
t
hymidine
)
HPCE Î wysokosprawna elektroforeza kapilarna (
ang.
h
igh
p
erformance
c
apilary
e
lectrophoresis
)
HUVEC Î ludzkie komrki endotelialne (
ang.
h
uman
u
mbilical
v
ein
e
ndothelial
c
ells
)
IEF
Î rodzaj elektroforezy wykorzystujacy rżnicę wartości punktu
izoelektrycznego rozdzielanych makrocząsteczek (
ang.
i
so
e
lectro
f
ocusing
)
IFN-
Î interferon gamma
IgG
Î immunoglobulina G
3
IgM Î immunoglobulina M
IODO-BEADS Î odczynnik, w postaci styrenowych kuleczek z immobilizowaną formą
chloraminy, stosowany do znakowania białek promieniotwrczym izotopem
jodu
K Î symboliczny zapis tysiaca (kilo), umownie w notacji biologicznej stosuje się
duzą literę, choć układ SI rezerwuje dla tego celu małą literę k
M Î symboliczny zapis miliona (mega)
Mab Î symboliczne oznaczenie przeciwciała monoklonalnego (
ang.
m
onoclonal
a
nti
b
ody
)
MHC Î ciężki łańcuch miozyny (
ang.
m
iosine
h
eavy
c
hain
)
MW Î masa cząsteczkowa (
ang.
m
olecular
w
eight
)
NP-40 Î detergent niejonowy nonident P-40
pI Î punkt izoelektryczny - taka wartość pH, w ktrej wypadkowy ładunek
elektryczny cząsteczki jest rwny zeru (
ang.
i
soelectric
p
oint
)
PBS Î wodny roztwr soli fizjologicznej (0,9% NaCl) buforowanej fosforanami, pH
7,4
(
ang.
p
hosphate
b
uffered
s
aline
)
PCR Î reakcja łańcuchowa oparta na zastosowaniu polinukleazy (
ang.
p
olinuclease
c
hain
r
eaction
)
PLCγ2 Î enzym fosfolipaza Cγ2
PMSF Î
p
henyl
m
ethyl
s
ulfonyl
f
luoride - inhibitor proteaz serynowych
RPMI - medium do hodowli komrek
SDS Î silny detergent jonowy (
ang.
s
odium
d
odecyl
s
ulfate
)
SDS-PAGE Î żelowa elektroforeza płytowa wykonywana w akrylamidzie w obecności SDS
(
ang.
p
late
a
crylamide
g
el
e
lectrophoresis
)
Sephadex G-25 Î złoże do filtracji żelowej
SSCP Î technika badania polimorfizmu DNA (
ang.
s
ingle-
s
trand
c
onformation
p
olymorphism
)
T Î symbol nukleotydu
t
yminy
T Î procentowa zawartość akrylamidu i bis-akrylamidu w żelu
TBS Î wodny roztwr soli fizjologicznej (0,9% NaCl) buforowanej Trisem, pH 7,4
(
ang.
Tris
b
uffered
s
aline
)
TBST Î TBS z dodatkiem detergentu Tween 20
TCA Î kwas trjchlorooctowy (
ang.
t
ri
c
hloroa
c
etic
a
cid
)
TEMED Î N,N,NÓ,NÓ-tetramethylenediamine
Tris Î 2-amino-2-hydroxymethylo-1,3-propanediol
Triton X-100 Î niejonowy detergent (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)
Tween 20 Î niejonowy detergent (polyoxyethylenesorbitan monolaurate)
U
4
Î symbol nukleotydu
u
racylu
WSTĘP
Olbrzymia popularność technik elektroforetycznych we wszystkich dziedzinach
dotyczących nauk o życiu nakłada na producentw i dystrybutorw sprzętu do elektroforezy
zwyczajowy obowiązek dostarczania bieżącej i pełnej informacji o tych technikach, ich
możliwościach i nowych aplikacjach. Obowiązek ten realizowany jest całą gamą środkw,
poczynając od dostarczania użytkownikowi katalogw produktw firmy, not aplikacyjnych,
publikacji w firmowych periodykach, filmw instruktażowych czy szkoleń. Oferta ta
dostępna jest zwykle w języku angielskim i nie zawsze trafia do osb oczekujących na szybką
i pełną informację w języku polskim. Dotyczy to głownie początkujących pracownikw
badawczych, ktrych znajomość zagadnień technicznych oraz języka naukowego jest jeszcze
niepełna. Specjalnie z myślą o tych użytkownikach technik elektroforetycznych
przygotowane zostało niniejsze opracowanie. Nie oznacza to jednak, że doświadczeni
badacze nie znajdą w opracowaniu nowych pomysłw i informacji. Autorami przykładw są
pracownicy nauki dobrze posługujący się technikami elektroforetycznymi, żeby nie
powiedzieć eksperci w tej dziedzinie. Przykłady zostały dobrane i przedstawione z myślą
o przekazaniu możliwie dużej porcji informacji w dość skrtowej formie publikacji. Stąd
pełny opis czynności niezbędnych do wykonania wzbogacony o uwagi wskazujące
niebezpieczeństwo związane z wykonywaniem poszczeglnych czynności lub pozwalające
ominąć błędy w postępowaniu.
Opracowanie niniejsze nie stanowi w żadnym razie konkurencji w stosunku do
uznanych podręcznikw i monografii w zakresie elektroforezy. Jest pewnym uzupełnieniem
dostępnej literatury, wzbogaconym dokładnym wyspecyfikowaniem warunkw
przeprowadzenia doświadczenia oraz opisem oczekiwanych wynikw. Jako lekturę
pozwalającą na stosunkowo łatwe przyswojenie wiedzy w tej dziedzinie chcielibyśmy
wskazać monografię Reinera Westemeiera Electrophoresis in Practice, 2
nd
edition, A Wiley
Company, Weinheim 1997.
Z powodu ograniczonej objętości niniejszego opracowania zrezygnowano z opisu
aparatury, materiałw eksploatacyjnych, akcesoriw oraz odczynnikw stosowanych
w zaprezentowanych technikach elektroforetycznych. Wszystkie produkty firmy Amersham
Biosciences zaznaczone są w tekście wytłuszczoną czcionką. Pełną informację o tych
produktach można znaleźć w aktualnym katalogu firmy lub na stronie internetowej
www.amershambiosciences.com.
W zakończeniu wstępu edytorzy opracowania wyrażają swoje podziękowanie autorom
przykładw, ktrzy zechcieli znaleźć nieco czasu aby podzielić się swym doświadczeniem
z innymi. Chcemy rwnież podziękować Panu Andrzejowi Reńskiemu, Dyrektorowi
polskiego przedstawicielstwa firmy Amersham Biosciences, za zaproszenie nas do
przygotowania tego opracowania.
Łdź, Warszawa, październik 2002 rok
5
[ Pobierz całość w formacie PDF ]