Zagadnienia biotechnologia 2, Biotechnologia PWR, Semestr 5, Biotechnologia - Wykład, Notatki i pytania z ...
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->TWÓJ BIOTECHNOLOGhttps://www.facebook.com/twoj.biotechnolog1.Metabolity pośrednie – wszystko to , co powstaje ZAWSZE podczas metabolizmu komórki np.alkohole, aminokwasy, kwas glutaminowyBakterie :Witamina B12 –Pseudomonas denitryficansPrzemysł mleczarski –Streptomyces sp., Leuconostoc sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp.,Produkcja kwasu glutaminowego : ( nie jestem pewna czy one ie były zmodyfikowane, sprawdźcie to nawszelki wypadek)Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Chirobacterum sp.Kwas glukonowy –Acetobacter suboxidansFermentacja octowa –Acetobacter sp., Gluconobacter sp.,Metabolity pierwszorzędowe: są to niewielkie cząsteczki chemiczne, które mogą byćproduktami końcowymi podstawowych procesów metabolicznych lub ich produktamipośrednimiWażne przemysłowo metabolity pierwszorzędowe:- alkohole: alkohol etylowy- alkohole wielowodorotlenowe: glicerol- aminokwasy: Lys, Thr, Phe, Trp- kwasy organiczne: kwas octowy, kwas propionowy- cukry: fruktoza- polisacharydy: ksantan, gellan- witaminy: B2, B12Metabolity wtórne: wszystkie procesy przemiany materii o nieznanej lub drugorzędowej funkcjibiologicznej określane są mianem metabolitów wtórnych a przemiany których są wynikiemmetabolizmem wtórnym; charakteryzują się wielokierunkową aktywnością biologicznąProdukcja metabolitów wtórnych jest silnie uzależniona od warunków środowiskowych (składpodłoża, sposób hodowli).Faza intensywnego wzrostu mikroorganizmów TROFOFAZA. Metabolity wtórne produkowane są wIDIOFAZIE.Grupa ważnych idiolitów:- antybiotyki- czynniki nieantybiotyczne (leki)- toksyny- biopestycydyczynniki stymulujące wzrost roślin i zwierzątUkierunkowana biosyntezapolega na testowaniu, a potem stosowaniu szeregu dodatków do podłoża, naktórym rozwijają się mikroorganizmy, w celu ukierunkowania ich metabolizmu na związek, który nasinteresujePrekursory (zazwyczaj znamy szlak metaboliczny, w którym wytwarzany jest nasz związek, wiecwiadomo jakiego metabolitu pośredniego użyć, by został odpowiednio przekształcony)kwas fenylooctowy -> benzylopenicilinyspecyficzne aminokwasy -> aktynomycyny, tyrocydynyinduktory:Met -> cefalosporyna CTrp -> alkaloidy ergotoweVal -> tyrozynaMutageneza (izolujemy mutanty, u których stwierdziliśmy zwiększoną produkcję interesującego naszwiązku, można zbadać gdzie zaszła mutacja i tym samym określić szlak biosyntezy bądź znaleźćpotencjalny induktor)zmiana proporcji syntezowanych metabolitównowe związkibadanie szlaku biosyntezy metabolitu wtórnego2.13.PODSTAWOWE KIERUNKI DZIAŁAŃ BIOTECHNOLOGII:1)Przemysł fermentacyjny- wykorzystanie technologii fermentacji w ujęciu biotechnologicznym:browarnictwoprodukcja antybiotyków i innych związków dla medycynyprodukcja białka paszowego i konsumpcyjnegoprodukcja odczynników chemicznych i innych substancji biologicznych2) Technologia enzymów3)Technologia odpadów i śmieci (biodegradacja)4)Biologia środowiska naturalnego (biomonitoring)5)Biotechnologia materiałowa i surowcowaWszystkie te kierunki biotechnologii rozwijają się przede wszystkim dzięki działalnościmikroorganizmów i dzięki umiejętnemu wykorzystaniu ich aktywności4.Skąd biorą się szczepy mikroorganizmów użytecznych w przemyśle1. Znajdowanie mikroorganizmów w środowisku naturalnym, gdy znamy pożądaną cechęmikroorganizmu; etapy:- należy wybrać miejsce, w którym określone mikroorganizmy mogą występować- pobrać próbki i poddać je wstępnej obróbce- zwiększyć liczebności mikroorganizmów, które nas interesują, tzn. zrobić to techniką naturalnegowzbogacania, czyli inkubacji próbek w warunkach jakie są optymalne dla poszukiwanych mikrobów,np. w dużej temp jeśli szukamy termofili albo w kwaśnym środowisku jeśli szukamy acidofili- zidentyfikować mikroorganizmy2. kolekcje mikroorganizmów (gdy wiemy, jakiego organizmu potrzebujemy)Są to instytucje zajmujące się gromadzeniem szczepów mikroorganizmów, ich badaniami, klasyfikacją iidentyfikacją oraz poszukiwaniami nowych szczepów bądź ulepszaniem starychMetody hodowli wzbogaconej :znamy cechy jakich potrzebujemy, ale nie znamy mikroorganizmu, który je posiadaDobieramy właściwe środowiskonp. bakterii ektremofilnych szukamy w ekstremalnych środowiskach ( temperatura >100 C, lub< 0C ), w środowisku kwaśnym, zasadowym, zastosowanie enzymów z tych bakterii – zhypertermofilnych – do technologii PCR, z bakterii żyjących w niskich temperaturach – (psychrofilnych ) do oczyszczania ściekówMetody określania ilości mikroorganizmów w warunkach przemysłowych (stosowane metodymuszą szybko dawać wynik)metody klasyczne- bezpośrednie, czyli obserwacja mikroskopowa (metoda DEFT (direct epifluorescens filtrettechnic) polega na liczeniu pod mikroskopem drobnoustrojów osadzonych na filtrzemembranowym, które wybarwiono uprzednio barwikiem fluorescencyjnym, możliwe jestrozróżnienie komórek żywych i martwych- pośrednie (metoda wagowa: sucha/mokra masa, metoda niedokładna)metody nowoczesne – instrumentalne (najczęściej optyczne)mierzy się:- aktywność enzymatyczna- poziom metabolitów- wybrane składniki komórki- pomiar zmian środowiskaza pomocą metod takich jak:- metody oparte na pomiarach turbidymetrycznych(np.pomiar zasobów pirogronianu:dehydrogenaza przekształca pirogronian w mleczan zużywając NADH, ubytek NADH sięoznacza mierząc absorbancje przy określonej długości fali;- pomiar bioluminescencji, np. oznaczanie ATP- np. pomiar oporności przepływu prądu przez pożywkę- metody NEFROLOMETRYCZNE polegające na mierzeniu zmętnienia-pomiary biofizyczne, np. pomiar oporności przepływu prądu przez pożywkę lub wzrostu jejprzewodności czy zmian siły jonowej(konduktacja) dla bardziej zanieczyszczonych hodowliPODAĆ 2,3 PRZYKŁADY WYKORZYSTANIA PRODUKTÓW OTRZYMYWANYCH ZE25.6.7.ZMODYFIKOWANYCH GENETYCZNIE MIKROORGANIZMÓW.1)LUDZKI HORMON WZROSTU-SOMATOTROPINA z E. coli, stosowany w leczeniu karłowatościprzysadkowej2)INSULINA (złożona z 2 łańcuchów polipeptydowych A i B, produkowanych odrębnie jako łańcuchyhybrydowe przez 2 rodzaje zmodyfikowanych genetycznie bakterii m.in. E.coli. Następnie w spodówenzymatyczny łańcuchy A i B są oddzielane od hybryd z niepotrzebnymi fragmentami i scalanie ich wfunkcjonalne białko-insulinę)3)CZYNNIKI KRZEPLIWOŚCI KRWI (lek stosowany u ludzi chorych na hemofilie), głównie czynniki7,8,9 gdyż hemofilityków nie są one syntetyzowane)4)REKOMBONOWANE IMMUNOSZCZEPIONKI, białka otoczek wirusa, białka powierzchniowebakterii o właściwościach antygenowych)wirusowe zapalenie wątroby typu Bwściekliznagrypa i inne choroby wirusowe5) HORMONY ZWIERZĘCE:somatotropina wołowa – mleczność krówpodpuszczka- chymozyna6) ENZYMY HYDROLITYCZNE pochodzenia mikrobiologicznegolipazyamylazyproteazycelulazy8.Wykorzystanie ekstremofili.EKSTREMOFILE – mikroorganizmy bytujące w środowisku, w którym panują skrajne warunki podokreślonym względem (np. temperatury, ciśnienia, zasolenia, pH). Z tych organizmów najczęściej izolujesię ekstremozymy, enzymy które zachowują aktywność w warunkach, w których inne enzymy zawodzą,np.:Termofile: np. zastosowanie w reakcji PCR (Thermophillus aquaticus), Piekarnictwo,browarnictwo,psychrofile: detergentyAcidofile: w oczyszczaniu metali (np. ekstrakcji miedzi z pirytu) oraz odsiarczaniu węglaAlkalofile: głównie w przemyśle detergentów, np. amylazy w proszkach do praniaHalofile: w produkcji biopolimerów, a także w syntezie oligopeptydów zawierających glicynęradiofile: (Wysokie promieniowanie) Całe mikroorganizmy stosowane są w oczyszczaniumiejsc skażonych pierwiastkami radioaktywnymi.J Jakie znasz cząsteczki biokatalityczne :RybozymyAbzymyDeoskyrybozymyMikrozymy – drobne polipeptydy o masie < 10 k DaZastosowanie :- 17 aminokwasowa mikroesteraza zBacillus Stearothermophilus- reninopochodne proteazy 79 aminokwasów- enzymy z archeonów katalizuje tworzenie mostków siarczkowychStanowią szanse tworzenia mimetyków na drodze enzymatycznej – model tworzenia katalizatorachemicznego.10Plastik biotechnologicznyRóżnego rodzaju materiały polimerowe zawierające w swojej strukturze zmodyfikowane enzymy, tak byzachować ich aktywność; tego rodzaju katalizatory są aktywne i stabilne w wodzie oraz wrozpuszczalnikach organicznych stosowane np. z enzymami proteolitycznymi; kompozyty organiczno -nieorganiczne wchodzące w skład bioplastyku (np.polimetylometakrylan, ksylen, octan winylu, eterwinylo-etylowy) zapewniają mechaniczną stabilność katalizatora i zwiększają wytrzymałość cząsteczkibiałka na war zewnętrzne (temp, zw chem).; stosowane jako złoża w bioreaktorachWYTLUMACZ POJĘCIE BIOKATALIZY KOMBINATORYJNEJ I BIOSYNTEZY39.11.KOMBINATORYJNEJ NA PRZYKŁADACH:Biotechnologia nowoczesna dysponuje biosyntezą kombinatoryjną, wykorzystującą technikirekombinacji DNA metodami inżynierii genetycznej i biologii molekularnej. Większość enzymówszlaków biosyntez jest u bakterii kodowana przez układy klasterowe. Do danego operonu można dodaćgen, którego produktu bakteria normalnie nie wytwarza.biokat komb - wykorzystanie kom mikroorg lub enzymów do tworzenia bibliotek związków na drodzepowtarzających sie biotransformacji modelowego substratu; np modyfikacje flawonoidów za pomocąróżnych układów enzymów i różnych donorów arylowychbiosynteza komb - zmana sekwencji genów i ich produktów w zaplanowany sposób (kominatoryjnie) npkombinatoryjnie = otrzymywanie biblioteki różnych związkówtworzona gdy chcemy modyfikować związki12Aspartam – zastosowanie biokatalizy, słodki dipeptydOtrzymywany jest na skalę przemysłową biotechnologicznie, w dwóch reakcjach katalizowanychenzymem, pierwsza z nich stanowi przykład stereoselektywności. Katalizuje ją aspartaza(amoniakoliaza, używa się immobilizowanych komórek lub immobilizowanego enzymu – zależnie odproducenta), substrat: amoniak lub inny związek zawierający zredukowany azot i kwas fumarowy, doktórego grupa aminowa może być dołączona w dwóch miejscach, tu – powstaje tylko kwas L-asparaginowy, a nie mieszanina enancjomerów.Druga reakcja – jednocześnie przykład regioselektywności biokatalizy – wiązanie peptydowe możepowstać na dwa sposoby: grupa aminowa estru metylowego L-Phe może utworzyć wiązanie amidowe zjedną z dwóch grup karboksylowych Asp, w przypadku syntezy chemicznej jedna z nich musiałaby byćzablokowana selektywnie. W warunkach przemysłowych katalizuje się reakcję tworzenia wiązaniapeptydowego z właściwą grupą karboksylową termolizyną.fumaran + NH3→->L-asparaginian (w odpowiedniej konfigruacji, aspartaza)L-asparaginian + ester metylowy L-Fenyloalaniny → aspartam (dipeptyd)(termolizyna)Biosynteza aspartamu- enzym w postaci enzymatycznej lub całej komórki, zawsze immobilizowanyOtrzymywanie semisyntetycznych penicylin :Penicyliny semisyntetyczne zostały wprowadzone zostały wprowadzone pod koniec lat 50-tych. Wzależności od rodzaju mają wąski lub szeroki zakres działania. Najbardziej znaną penicylinąsemisyntetyczna jest AMPICYLINA – jest ona najprostsza i jako pierwsza została wprowadzona dolecznictwa; ANOKSYCYKLINA – zmodyfikowana ampicylina, ma ona korzystniejsze właściwościfarmakologiczne.Otrzymywanie semisyntetycznych penicylin:Penicyliny semisyntetyczne powstają z kwasu 6-AMINOPENICYLINOWEGO (6-APA). Kwas tenmożna otrzymać na drodze chemicznej lub enzymatycznej hydrolizy penicyliny G lub V. Penicylinę do6-APA hydrolizuje acylaza penicylinowa. 6-APA można tez otrzymać z penicyliny poprzez produktpośredni: diacylopenicylinę.Acylaza penicylinowa jest enzymem dezaktywującym penicyliny (beta-laktamy). Używa się tegoenzymu w postaci wolnej lub immobilizowanej, lub w postaci całych, wolnych lub immobilizowanychkomórek mikroorganizmów (bakterie produkują acylazy bardziej specyficzne do penicyliny G, grzyby –do p. V).6-APA acyluje się odpowiednim łańcuchem bocznym i powstaje semisyntetyczna penicylina (połowaprocesu produkcyjnego na drodze biokatalitycznej – acylaza penicylinowa, druga polowa ja drodzechemicznej – dodanie łańcuch bocznego).1314Otrzymywanie akrylamidu z wykorzystaniem biokatalizyProces prowadzony w temp 10C ze 100% wydajnością, wymaga aktywności hydratazy nitrylowejOCNCChydrataza nitrylowaNH2CCProces mikrobiologiczny wymaga tylkoprzygotowania biokatalizatora (mikroorganizmy, które wykazują dużą aktywność hydrolizującą nitryle,lecz nie mają aktywności amidazowej, szczepy selekcjonowane są ze względu na tą aktywność) w4akrylonitrylakrylamidodróżnieniu od wielostopniowej syntezy chemicznej w wysokiej temperaturze i wymagającejkatalizatora.15NA CZYM POLEGA PROCES MUTASYNTEZY (NA PRZYKŁADZIE PROD.AMINOGLIKOZYDOWYCH ANTYBIOTYKÓW):Mutasyntezę stosuję się do produkcji antybiotyków aminoglikozydowych:mutanty idiotropowe,niezdolne są do syntezy jakiegoś z aminocukrów, zamiast tego aminocukru stosuję się inny, który jestwbudowywany w produkt.Jest to próba otrzymania w ten sposób zmiany proporcji syntezowanych metabolitów w kierunkuzwiekszenia produkcji danego związku lub w celu badania szlaku biosyntezy tego metabolitu.Mutageneza w ujęciu tradycyjnym: szereg mutantów→izolacja pod względem wytwarzaniainteresującego metabolitu→badanie w którym miejscu jest ta mutacja→dedukcja szlaku metabolicznegoWymień mikroorganizmy wykorzystywane do produkcji metabolitów wtórnych:Metabolity wtórne to metabolity wytwarzane tylko u pojedynczych gatunków lub grup spokrewnionychgatunków, albo tylko w niektórych tkankach lub szczególnych warunkach środowiska. Często są tozewnątrzkomórkowe substancje sygnałowe lub ochronno-obronne, np.:Penicillum - Penicylina,Streptomyces- antybiotyki aminoglikozydowe, streptomyces-przeciwnowotworoweBacillus subtilis – biosurfaktantyBacillus thuringiensis - bioinsektycydyŻywe bioreaktory i ich wykorzystanie :Wykorzystanie komórek z żywych organizmów do eskpresjonowania genów np.- kom. gruczołów mlecznych: myszy, kóz, owiec, królików, krów - bo wydzielanie białek z mleka jestprostaduża wydajnośćtransgeniczne kozy - synteza antytrombiny III -czynnik krzepliwości krwikom. jaj transgenicznych kur - białka terapeutycznekom. transgenicznych roślinnowoczesne jadalne immunoszczepionki np. w sałacieprzeciwciała monoklonalnekom. śledziony transgenicznych myszy (XENOMOUSE)limfocyty zaw. sekwencje ludzkich immunoglobulinNowoczesna biotechnologia w medycynie1) Human Genome Project - badanie genomu ludzkiego, sekwencjonowanie DNA2) Poszukiwanie rozwiązań dot. ekspresjonowania białek eukariotycznych w komórkach prokariotalub drożdżach (np. E.coli produkująca somatotropinę)3) Żywe bioreaktory - ekspersja białek heterologicznych w gruczołach mlecznych myszy,królików, owiec, krów i kóz ( np. trasngeniczne kozy - w ich gruczołach mlecznychekspresjonuje się jeden z czynników krzepliwości krwi)4) Technologia wytwarzania przeciwciał monoklonalych (myszy+komórki szpiczaka) –szczepionki, immunotesty, nośniki leków5) Terapia genowa (geny supresorowe, geny samobójcze wywołujące apoptozę komórki np. jakoszczepionki przeciwnowotworowe)6) Biochipy – precyzyjna analiza mutacji w badanych białkach za pomocą komplementarnychoddziaływań7)Klonowanie i komórki macierzyste (możliwość wyhodowania każdej tkanki np. dotransplantacji)DLACZEGO PRODUKCJA PIWA JEST PROCESEM BIOTECHNOLOGICZNYM:Z wyjątkiem ostatnich etapów: filtracji, oddzielaniu drożdży przez wirowanie- produkcja piwa jest ściśleoparta na procesach biologicznych:a)substraty naturalne:produkty rolne, zbożaa) przygotowanie słodu-naturalny proces kiełkowania nasion jęczmienia, podczas którego następujeenzymatyczny rozkład skrobi i białek zapasowych ( przy udziale własnych enzymów ziarna: α i βamylazy, β- glukanazy i endopeptydazy).Słód to przede wszystkim mieszanina cukrów przyswajalnychprzez drożdżeb)przygotowania brzeczki-w procesie ekstrakcji z chmielem, wciąż działają α-amylazy wytwarzającecukry na potrzebe drożdży.516.17.18.19. [ Pobierz całość w formacie PDF ]