Zastosowanie bakterii fermentacji mlekowej w biotechnologii, Mikrobiologia, Mikrobiologia
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Wykład:
Zastosowanie bakterii fermentacji mlekowej w biotechnologii
Po co nam biotechnologia ?

W odniesieniu do produkcji żywności celem biotechnologii jest:
opracowanie sposobów poprawienia cech organoleptycznych produktów (koloru, smaku, zapachu)

ich wartości odżywczej (zawartości białek, lipidów i sacharydów)

modyfikacje cech produkcyjnych roślin (np. opóźnienie dojrzewania, odporność na suszę, zasolenie
czy też na szkodniki, obniżenie kosztów produkcji roślinnej).
Równie ważne jest:
o
zapewnienie bezpieczeństwa zdrowotnego żywności (zwalczanie patogenów i szybkie testy na ich
wykrywanie)
o
możliwość pozyskiwania żywności funkcjonalnej, tzn. wzbogaconej np. w witaminy, mikro- i
makroelementy oraz inne cenne składniki odżywcze lub też o obniżonej zawartości składników
antyodżywczych
o
produkcja roślin zawierających substancje farmakologiczne, czyli tzw. jadalne szczepionki, rośliny
zawierające określone leki
Wymagania wobec mikroorganizmów stosowanych w biotechnologii:

stabilizacja cech genetycznych, fizjologicznych, morfologicznych i technologicznych

szczególnie przy produkcji z użyciem drogich składników i w dużej ilości, gdyż wymienione składniki
rzutują na efektywność ekonomiczną przedsięwzięcia

dotyczy to głównie organizmów zmodyfikowanych genetycznie, gdyż nakłady finansowe na
otrzymanie rekombinantu o pożądanych cechach są znaczne, zaś stabilność genetyczna organizmu
labilna
Zaburzenia procesów biotechnologicznych
Mimo zachowania wszelkich zasad GLP (dobrej praktyki laboratoryjnej) lub GMP (dobrej praktyki
przemysłowej) może dojść do zaburzeń procesów biotechnologicznych:
• zakłócenia założonych warunków inżynieryjnych i w efekcie wydajności procesu
• utraty
właściwości użytkowych technologicznych przez mikroorganizm
stosowany w procesie
biotechnologicznym
• zmiany warunków hodowli lub otrzymywanych produktów
Zaburzenia procesów biotechnologicznych
bakteriofagi → straty finansowe
LAB w biotechnologii
Biosynteza aminokwasów:
o
L-lizyna (rodzaj LAB:
Brevibacterium
)
o
kwas L-glutaminowy (rodzaj LAB:
Brevibacterium
)
Wiadomo, że drobnoustroje syntetyzują wiele aminokwasów niezbędnych do budowy specyficznych białek.
Geny odpowiedzialne za biosyntezę poszczególnych aminokwasów „kontrolują” aktywność enzymów
biorących udział w biosyntezie danego aminokwasu, aby nie dopuścić do jego nadprodukcji.
W wyniku selekcji drobnoustrojów można uzyskać organizmy przydatne do przemysłowej produkcji
aminokwasów.
Jednocześnie przez dobór warunków hodowli, a zwłaszcza
mutagenizację
drobnoustrojów metodami
fizycznymi, chemicznymi lub inżynierii genetycznej, można uzyskać organizmy zdolne do nadprodukcji
danego aminokwasu.
Strona 1
Mutagenizacja
- wywołuje zmiany kierunków metabolicznych w wyniku zmiany aktywności określonych
enzymów, co powoduje zahamowanie biosyntezy niektórych aminokwasów i nadprodukcję pożądanego.
Umożliwia uzyskanie drobnoustrojów z rozkojarzonym systemem regulacji, nadprodukujących dany
aminokwas ze związku chemicznego, który jest prekursorem
dla zahamowanej biosyntezy innych aminokwasów.
Uwaga:
Aminokwas, którego biosynteza została zahamowana, powinien być dodawany do pożywki.
Przebieg biosyntezy L-lizyny
1. aminotransferaza glutaminianowa przekształca szczawiooctan z cyklu kwasów trikarboksylowych
w L-asparaginian,
2. kinaza asparaginowa przekształca L-asparaginian do semialdehydu β-asparaginowego,
3. enzymem decydującym o syntezie L-lizyny z semialdehydu jest syntetaza dihydrodipikolinianowa,
4. jej aktywność jest kilkunastokrotnie mniejsza od aktywności dehydrogenazy homoserynowej, katalizującej
syntezę L-metioniny, L-treoniny i L-izoleucyny,
5. aktywność kinazy asparaginowej można w 90 % zahamować nadmiarem L-lizyny i L-treoniny, natomiast
L-izoleucyna i L-walina zwiększają jej aktywność o 50 %, znosząc jednocześnie hamujące działanie L-
lizyny i L-treoniny,
6. w biosyntezie mikrobiologicznej L-lizyny używa się mutantów auksotroficznych, które nie syntetyzują
dehydrogenazy homoserynowej lub mutantów regulatorowych, których kinaza asparaginowa jest
niewrażliwa na obecność analogu L-lizyny i L-treoniny,
7. najkorzystniej jest używać drobnoustrojów wykazujących te dwa rodzaje mutacji
Biosynteza kwasu L-glutaminowego
1. powstający w cyklu kwasów trikarboksylowych 2-oksoglutaran ulega przemianie do kwasu L-
glutaminowego w obecności dehydrogenazy glutaminianowej lub też może ulec dalszej przemianie w
cyklu Krebsa zapoczątkowanej przez dehydrogenazę 2-oksyglutaranową.
2. u auksotroficznych mutantów aktywność dehydrogenazy oksyglutaranowej jest bardzo mała, natomiast
dehydrogenazy glutaminianowej bardzo duża, co zapewnia nadprodukcję kwasu L-glutaminowego.
Biosynteza antybiotyków i bakteriocyn:

nizyna → lantybiotyk obecnie zaliczany do bakteriocyn (niektóre szczepy
Lactococcus lactis
subsp.
lactis
)

bakteriocyny → bioutrwalanie żywności nie tylko fermentowanej (różne rodzaje LAB)
Bakteriocyny bakterii G(+)
Generalnie, bakteriocyny bakterii Gram-dodatnich dzieli się na 4 klasy:
I) lantybiotyki - peptydy o masie cząsteczkowej poniżej 5 kDa, zawierające w swojej cząsteczce tioeterowy
aminokwas lantioninę, a czasem także 3-metylolantioninę. Są to substancje ciepłostabilne, o średnim lub
szerokim spektrum działania, np. nizyna, laktycyny;
II) peptydowe bakteriocyny - małe, nielantybiotykowe peptydy, o masie cząsteczkowej poniżej 10 kDa,
ciepłostabilne, o średnim lub szerokim spektrum działania, np. pediocyna AcH, sakacyna A,
laktokokcyny, leukocyna UAL 187, enterocyna A, mesenterycyna Y105, diwercyna V41;
III) białkowe bakteriocyny - nielantybiotykowe białka, ciepłolabilne, o masie cząsteczkowej ponad 10 kDa,
o wąskim spektrum działania, np. helwetycyna J, helwecyna J, kaseicyna 80;
IV) kompleksy białkowe - zawierające cząsteczkę cukru lub lipidu niezbędną do ich aktywności,
ciepłostabilne, o średnim spektrum działania, np. leukonocyna S, pediocyna SJ-1.
Nizyna
Nizyna (wykryta w 1947 r.) jest jedyną bakteriocyną produkowaną w skali przemysłowej.
Nie hamuje rozwoju Gram-ujemnych bakterii, drożdży i pleśni, natomiast hamuje rozwój szeregu szczepów
Strona 2
bakterii z rodzajów
Staphylococcus, Micrococcus, Clostridium, Bacillus, Listeria, Lactococcus
i
Lactobacillus
.
Uszkadza ścianę komórkową komórek wegetatywnych, ale nie działa na przetrwalniki, chociaż uniemożliwia
przekształcenie się ich w formy wegetatywne.
Jest trawiona przez trypsynę i nie wywołuje oporności oraz jest nietoksyczna dla organizmów wyższych,
dlatego jest bezpieczna dla zdrowia człowieka.
W większości krajów nie ustalono maksymalnego poziomu jej dodatku do żywności.
Znalazła zastosowanie w przemyśle spożywczym, a zwłaszcza w produkcji konserw owocowo-warzywnych,
jako że zachowuje swoją aktywność w temp. 121
o
C przez 15-20 min. (dodanie jej umożliwia obniżenie
temperatury obróbki konserw warzywnych).
Dodatek nizyny do produktów mięsnych, serów topionych, mleka przy produkcji serów (zapobiega rozwojowi
bakterii masłowych, a tym samym wzdymaniu serów).
W niektórych krajach dopuszcza się stosowanie nizyny w produkcji mleka, serów i deserów mlecznych
oraz innych napojów, co zapobiega ich kwaśnieniu.
Biosynteza nizyny
Selekcja szczepów do produkcji nizyny jest bardzo trudna ze względu na ich wrażliwość na
bakteriofagi
.
Szczepy
Lc. lactis
subsp.
lactis
odporne na fagi syntetyzują mało nizyny.
Ponieważ w hodowli
Lc. lactis
subsp.
lactis
często obserwuje się zakażenie dzikimi drożdżarni, przygotowanie
inokulum wymaga szczególnej staranności.
W celu uzyskania wymaganej objętości inokulum prowadzi się wielostopniową hodowlę lub też kilka hodowli
o małej objętości pożywki.
Najlepszą pożywką do hodowli bakterii jest sterylizowane mleko pełne, odtłuszczone lub regenerowane.
Hodowlę prowadzi się w warunkach beztlenowych, utrzymując kwasowość pożywki na stałym poziomie.
W celu wydzielenia nizyny, pożywkę po hodowli zakwasza się do pH 2, aby uwolnić nizynę zaadsorbowaną
na powierzchni komórek.
Po odwirowaniu roztwór doprowadza się pH 4,5 i dodaje chloroform oraz izooktanol.
Warstwę zawierającą chloroform wraz z nizyną oddziela się i dodaje ochłodzonego absolutnego alkoholu,
co powoduje wytrącenie nizyny.
Osad nizyny w temp. 50
o
C rozpuszcza się w HCl, a następnie wysala, używając NaCl.
Preparat nizyny w postaci proszku w temp. 18-22
o
C zachowuje aktywność przez kilka lat.
Biosynteza polisacharydów (egzopolisacharydów, EPS):

polisacharydy otoczkowe(m.in. rodzaj
Lactobacillus
)

dekstran (
Leuconostoc mesenteroides
subsp.
mesenteroides
i
Ln. mesenteroides
subsp.
dextranicum
)
Uwaga:
LAB nie są stosowane do biosyntezy m.in. białek i lipidów.
Polisacharydy otoczkowe
Egzopolimery produkowane przez LAB są polisacharydami zbudowanymi z rozgałęzionych, powtarzających
się jednostek połączonych wiązaniami α- i β-glikozydowymi, wydzielane w wielu odmianach.
Jakkolwiek, skład cukrowy polimerów pozostaje podobny: prawie zawsze są obecne D-galaktoza, D-glukoza,
L-ramnoza, różnią się jedynie wzajemnym stosunkiem molowym.
W polisacharydach mogą być również obecne inne reszty, np.
sn
-glicerolo-3-fosforan, N-acetyloaminocukry,
grupy fosforowe i acetylowe.
Środowisko i warunki hodowli są jednym z czynników wpływających na skład cukrowy i odmiany wiązań
glikozydowych.
Masa egzopolisacharydów produkowanych przez LAB waha się od 1 × 10
4
do 1 × 10
5
.
Fizyczne i reologiczne właściwości polisacharydów zależą od struktury 3-wymiarowej lub przestrzennej
konformacji.
Strona 3
Natomiast 2- i 3-rzędowa struktura zależy od składu chemicznego polimeru.
Chociaż nawet niewielka zmiana w strukturze 1-rzędowej, może mieć ogromny wpływ na konformację i
właściwości EPS.
Znaczenie przemysłowe EPS wynika z ich właściwości emulgujących i reologicznych.
Heteropolisacharydy produkowane przez mezofilne
i termofilne LABw wpływają na konsystencję i strukturę jogurtów i innych fermentowanych napojów
mlecznych.
Lewan znalazł zastosowanie w przemyśle spożywczym jako doskonały biozagęszczacz.
Polisacharydy otoczkowe produkowane przez LAB mogą wywoływać również niepożądane efekty:
powodują zatykanie filtrów i rur (dekstrany i lewany przyczyniają się do strat sacharozy w przemyśle
cukrowniczym).
Dekstran
Dekstran jest polisacharydem zbudowanym z glukozy połączonej wiązaniami α-(1-6)-D-glikozydowymi.
Między resztami glukozowymi są wiązania α-(1-4)-
i α-(1-3)-D-glukozydowe, tworzące „łańcuchy” boczne.
Wiązania α-(1-6)-D-glikozydowe stanowią 90 – 95 % wiązań glikozydowych w dekstranie, chociaż występuje
również dekstran, w którym wiązania α-(1-6)- stanowią poniżej 50 %.
Masa cząsteczkowa dekstranu wynosi od 5 x 10
4
do 3 x 10
8
Da.
Jest jasnożółtym lub białym proszkiem.
W wodzie tworzy roztwór koloidalny o różnej lepkości, zależnie od ilości i stosunku między wiązaniami α-(1-
6)- α-(1-4)- i α-(1-3)-D-glikozydowymi.
W technologii żywności może być stosowany jako zagęstnik, dzięki któremu można uzyskać półstałą
konsystencję produktów.
Dotychczas dekstran nie jest dopuszczony jako dodatek do żywności (ang.
food additive
), chociaż
opatentowano wiele możliwości zastosowania dekstranu.
Bakterie zasiedlające jelita człowieka i zwierząt są zdolne do rozkładu dekstranu, co powoduje szybki wzrost
zawartości cukru we krwi oraz glikogenu w wątrobie (niewydalony dekstran jest metabolizowany w
wątrobie do CO
2
i wody).
Dekstran jest polecany jako bezpieczny biodegradowalny składnik
opakowań
dla żywności.
W 1942 r. Szwed Ingelman zaproponował użycie hydrolizatu dekstranu jako zamiennika plazmy krwi.
Obecnie dekstran o masie cząsteczkowej 70 000 i 40 000 jest stosowany w medycynie, zwłaszcza po urazach
chirurgicznych.
Od 1959 r. dekstran jest również używany do produkcji żeli Sephadex, co przyczyniło się do znacznego
postępu w analityce i technikach rozdziału substancji.
Do produkcji dekstranu na skalę przemysłową, w większości krajów, używa się szczepu
Leuconostoc
mesenteroides
NRRL B12(F) lub
Leuconostoc
mesenteroides
B512.
Proces biosyntezy dekstranu przebiega w dwóch etapach:
o
nagromadzenie enzymu dekstranosacharazy,
o
konwersja sacharozy do dekstranu.
Początkowe pH pożywki wynoszące 6,7 - 7,2 w miarę trwania hodowli obniża się do 6,4 - 6,9. Wówczas
obserwuje się syntezę dekstranosacharazy (najintensywniej w pH 6,7).
Konwersja do dekstranu najintensywniej zachodzi przy pH 5,2.
Duże znaczenie ma zawartość sacharozy w podłożu, która powinna być większa od 2%. Dlatego podczas
hodowli ciągłej stosuje się zasilanie hodowli sacharozą.
Strona 4
Biosynteza witamin:

witamina B
12
(bakterie propionowe:
Propionibacterium shermanii
i
P. freudenreichii)
W procesie biosyntezy witaminy B
12
ważny jest dodatek do pożywki soli kobaltowych, niezbędnych dla
syntezy witaminy, chociaż stężenie kobaltu w pożywce przekraczające 50 ppm hamuje biosyntezę
witaminy.
Również dodatek betainy lub choliny stymuluje syntezę witaminy.
W hodowli niektórych drobnoustrojów stosuje się dodatek 5,6-dimetylo-benzoimidazolu, który odgrywa
znaczącą rolę w syntezie witaminy B
12
jako jeden z jej prekursorów witaminy.
P. freudenreichi
ATCC 6207 i
P. shermanii
ATCC 13673 są zdolne do syntezy 5,6-dimetylo-benzoimidazolu
w znacznych ilościach.
Dlatego biosyntezę witaminy B
12
przez te bakterie prowadzi się w 2 etapach:

w warunkach beztlenowych prowadzi się namnażanie biomasy i synteza kobinoamidu,

w warunkach tlenowych prowadzi się syntezę prekursora i powstanie witaminy B
12
Hodowle bakterii propionowych prowadzi się przez kilka dni w temp. ok. 30
o
C przy pH na poziomie 6,5 -
7,0.
W celu otrzymania paszowego koncentratu witaminy B
12
całość płynu pohodowlanego wraz z bakteriami
propionowymi (witamina B
12
jest nagromadzana wewnątrz komórek) suszy się metodą rozpryskową.
Biosynteza enzymów:

Β-D-galaktozydaza (LAB z rodzajów
Lactococcus, Lactobacillus
) - rzadko stosowane !
Produkcja kwasu mlekowego i mleczanów:
o
najczęściej z serwatki, melasy, lub podobnych odpadów przemysłowych
o
LAB z rodzaju
Lactobacillus
(badania nad wykorzystaniem
Bifidobacterium
)
o
LAB heterofermentatywne potrafią wykorzystać do tego celu nie tylko proste cukry i dwucukry , ale także
cukry złożone, np. skrobię
Produkcja kwasu propionowego i propionianów:

najczęściej z serwatki, melasy,

LAB z rodzaju
Propionibacterium

jednocześnie można wytwarzać witaminę B
12
na cele paszowe
Biosynteza związków aromatotwórczych:

związki karbonylowe (LAB z rodzajów
Lactobacillus, Streptococcus, Propionibacterium
) -
wykorzystywane podczas fermentacji żywności
Inne wykorzystanie LAB w biotechnologii:
o
hodowla szczepów probiotycznych
o
kultury starterowe (w tym GMO)
o
wykorzystanie LAB w medycynie
Cel modyfikacji genetycznych - przykłady:
o
zdolność do metabolizowania galaktozy
o
obniżanie poziomu cholesterolu w serum krwi lub ciśnienia tętniczego
LAB w biotechnologii
Obecnie w technologii produkcji
kultur starterowych s
tosuje się selekcję, która umożliwia dobór szczepów
odpornych na bakteriofagi.
Strona 5
[ Pobierz całość w formacie PDF ]