Zastosowanie mikrobiocydów alkiloamoniowych do ochrony papieru przed grzybami strzępkowymi, Artykuły z ...
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->PRACE NAUKOWO - BADAWCZEZastosowanie mikrobiocydów alkiloamoniowychw ochronie papieru przed grzybamistrzępkowymiApplications of alkylammonium microbiocidesto protect paper materials against mouldsANNA KOZIRÓG, BEATA GUTAROWSKA, BOGUMIŁ BRYCKIW artykule przedstawiono wyniki badań skuteczności mikrobiocydówalkiloamoniowych ograniczających populację grzybów strzępkowycho właściwościach celulolitycznych, powodujących biodegradacjęwyrobów papierniczych.Słowa kluczowe:biocydy, ochrona papieru, grzyby strzępkoweThe article provides results of biocidal efficacy of alkylammoniummicrobiocides against cellulite fungi which are responsible for bio-degradation of paper materials.Keywords:biocides, paper protection, mouldsWprowadzeniePapier należy do materiałów technicznych, które są szcze-gólnie wrażliwe na niszczącą aktywność mikroorganizmów,przede wszystkim grzybów. Grzyby strzępkowe odpowiedzialneza biodegradację papieru pojawiają się już na etapie produkcji,a ich dalszy rozwój w gotowych produktach zależy od sposobuprzechowywania (1-3). W korozji mikrobiologicznej gotowychwyrobów papierniczych biorą udział głównie mikroorganizmy,które mają zdolność do hydrolizowania celulozy zawartej w pa-pierze. Rozwój grzybów celulolitycznych w papierze powodujenie tylko zmiany na jego powierzchni, ale również zmienia che-miczną i fizyczną strukturę papieru (4). Skutkiem tego procesumoże być całkowite zniszczenie materiału. Zarodniki grzybów sąwszechobecne i mogą pochodzić nie tylko z samego papieru, alerównież z otaczającego środowiska, przede wszystkim z powie-trza. Zarodniki są mało wrażliwe na niesprzyjające środowiskozewnętrze i mogą w tych warunkach przetrwać wiele lat. Wi-doczne makroskopowo grzybnie mogą się rozwinąć nawet przyniewielkiej wilgotności.W celu ograniczenia rozwoju grzybów stosuje się mikrobiocydy,substancje chemiczne o działaniu przeciwdrobnoustrojowym,których właściwy dobór możliwy jest po określeniu mikroflorydominującej w danym środowisku. Z przeprowadzonych do-tychczas badań wynika, że każda postać morfologiczna pleśnireaguje inaczej na działanie środków biobójczych (5). Nie bezznaczenia pozostaje także wiek szczepu. Szczepy młode sąbardziej wrażliwe na działanie mikrobiocydów, w porównaniudo szczepów dojrzałych, które pozostają na powierzchni papieruw formie konidiów (6). Dlatego też, przed wyborem odpowied-niego preparatu biobójczego, istotne jest stwierdzenie, jakamikroflora występuje w miejscu przeznaczonym do dezynfekcji.Stosowanie mikrobiocydów w odpowiednim stężeniu i czasie dlakonkretnej mikroflory i danego środowiska powoduje inaktywacjęi skuteczne zniszczenie drobnoustrojów. Zły dobór związkówchemicznych może prowadzić nie tylko do tego, że proces dezyn-fekcji staje się nieskuteczny, ale co więcej, w dezynfekowanymobszarze mogą pojawić się formy oporne, które przystosowałysię do tych warunków.Celem przeprowadzonych badań była identyfikacja grzybówstrzępkowych wyizolowanych z pomieszczeń bibliotecznychw Polsce, ocena ich właściwości celulolitycznych oraz okre-ślenie wrażliwości na mikrobiocydy przygotowane na bazie solialkiloamoniowych.Część doświadczalnaIdentyfikacja grzybów strzępkowych i ich uzdolnienia ce-lulolityczneBadane szczepy grzybów strzępkowych wyizolowano z różnychpomieszczeń i zbiorów bibliotecznych w Polsce. Diagnostykęgrzybów przeprowadzono na podłożu Czapek (firmy Merck)i podłożu naturalnym – brzeczce (5°Blg) porównując cechymakro- i mikroskopowe wyizolowanych gatunków z kluczamidiagnostycznymi (7).Ocenę właściwości celulolitycznych określono na podłożuo pH=6,4 z dodatkiem celulozy jako jedynego źródła węgla.DrA. Koziróg,dr hab.B. Gutarowska,Instytut Technologii Fermentacjii Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, PolitechnikaŁódzka, 90-924 Łódź ul. Wólczańska 171/173; Prof. UAM dr hab.B. Brycki,Pracownia Chemii Mikrobiocydów, Wydział Chemii, Uniwersytet im. AdamaMickiewicza, 60-780 Poznań, ul. Grunwaldzka 6e-mail: anna.kozirog@p.lodz.pl, gustaw@p.lodz.pl, brycki@amu.edu.pl50PRZEGLĄD PAPIERNICZY · 68 · STYCZEŃ 2012PRACE NAUKOWO - BADAWCZEPodłoże na płytkach Petriego szczepiono mikroorganizmamipunktowo, inkubowano w temperaturze 27°C. Po 48 i 168 go-dzinach inkubacji, w celu sprawdzenia efektu hydrolizy celulozyprzez badane gatunki grzybów strzępkowych, powierzchnię pod-łoża zalano płynem Lugola i obserwowano strefy przejaśnieniawokół kolonii.Ocena skuteczności działania mikrobiocydów metodą dy-fuzyjnąDo oceny wybrano pięć najbardziej aktywnych celuloli-tycznie szczepów. Zastosowano pięć preparatów na bazieczwartorzędowych soli alkiloamoniowych, poliamin alkilowychi sekwestrantów, które przygotowano w Pracowni Chemii Mi-krobiocydów Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu.Skład mikrobiocydów podano w tabeli 1. Każdy preparat przy-gotowano w stężeniach 0,8; 0,4; 0,1; 0,05 i 0,01 μl/ml. Wartościminimalnych stężeń hamujących wzrost drobnoustrojów (MIC)wyznaczono metodą dyfuzyjną.Tabela 1. Substancje czynne w mikrobiocydach wykorzystywanych w ba-daniachSubstancje czynneOznaczenia mikrobiocydów/Zawartośćsubstancji czynnych (mg/g)M-1M-2M-3M-4M-51501501501501501734173434404060Rys. 1. Rodzaje grzybów strzępkowych w zbiorach bibliotecznych w Polsce(% całkowitej ilości wyizolowanych grzybów)Chlorki tetraalkiloamonioweaPoliaminy alkilowebSekwestrantyca)pomieszczeniach magazynowych, nazywane są też „pleśniamimagazynowymi” (8). Wśród badanych pleśni z rodzajuAsper-gilluszdiagnozowano 3 gatunki, a z rodzajuPenicillium– 7gatunków.Wyniki aktywności celulolitycznej wyizolowanych szczepówprzedstawiono w tabeli 2. Trzy spośród 22 izolatów nie wykazałyzdolności celulolitycznych –Alternaria tenussimai dwa gatunkiz rodzajuMucor.Najwcześniej, po 2 dobach hodowli, zdolnośćdo rozkładu celulozy zaobserwowano uChaetomium globosumiAspergillus flavus.Jednak największą aktywnością cechowałysięAspergillus niger, Penicillium cyclopiumiChaetomium glo-bosum,u których występowały największe strefy przejaśnieniawokół kolonii.Tabela 2. Gatunki grzybów strzępkowych wyizolowanych z badanychbibliotek i ich aktywność celulolitycznaAktywnośćcelulolitycznapo 7 dniach++++++++++++-+++++--++5. generacja soli tetraalkiloamoniowych (mieszanina chlorków dialkilo-dimetyloamoniowych (dioktylo, 25%; didecylo, 25%, oktylodecylo, 50%)z chlorkiem benzalkoniowym (C12, 40%; C14, 50%; C16, 10%) (11)b)bis(N,N-aminopropylo)-N-alkilo(C8- 25%, C12- 50%, C14- 25%) aminac)PBTC, NTARodzajGatunekwyizolowanych grzybów strzępkowych1AspergillusA. nigerA. flavusA. ochraceusP cyclopium.P terrestre.P purpurogenum.P variable.P notatum.P virdicatum.P albidum.A. tenussimaA. alternataC. herbarumC. macrocarpumCh. globosumM. hiemalisM. racemosusA. strictumW pierwszym etapie przeprowadzono standaryzację inokulumw celu uzyskania gęstości zarodników 106jtk/ml. Kolejno na płytkiz pożywką MEA (firmy Merck) wprowadzono 0,1 ml zawiesinyzarodników i rozprowadzono na całej powierzchni pożywki ste-rylnym gładzikiem. Następnie w pożywce wycinano studzienkiśrednicy 10 mm, do których wprowadzano przygotowane wcze-śniej roztwory badanych preparatów. Tak przygotowane hodowleinkubowano 48 godzin w temperaturze 27°C. Po tym czasie ob-serwowano strefy zahamowania wzrostu grzybów strzępkowychwokół studzienek. Wielkości strefy wyliczono wg wzoru:2Penicillium3456AlternariaCladosporiumChaetomiumMucorAcremoniumFusarium sp.gdzie:X – wielkość strefy zahamowania wzrostu,A – średnica strefy bez widocznego wzrostu,B – średnica otworu wyciętego w pożywce, do którego wpro-wadzono biocyd.78Omówienie wynikówSpośród wyizolowanych grzybów strzępkowych dominowałydwa rodzaje –AspergillusiPenicillium(rys. 1). Są to grzy-by powszechnie występujące w środowisku, m.in. w glebiei powietrzu, powodujące psucie żywności czy biodeterioracjędrewna i papieru. Ze względu na ich częstą obecność w różnychNa podstawie przeprowadzonych badań wytypowano mikro-florę dominującą, która charakteryzowała się uzdolnieniami ce-lulolitycznymi. Do tej grupy należą:Aspergillus niger, Aspergillusochraceus, Chaetomium globosum, Penicillium terrestreiPeni-cillium cyclopium.Powyższe drobnoustroje poddano działaniumikrobiocydów M-1 – M-5. W tabeli 3 przedstawiono wartościminimalnych stężeń testowanych środków przeciwgrzybowychwobec pięciu testowanych gatunków grzybów strzępkowych. Napodstawie tych wyników określono wartości MIC, które zebranow tabeli 4.PRZEGLĄD PAPIERNICZY · 68 · STYCZEŃ 201251PRACE NAUKOWO - BADAWCZETabela 3. Wielkość stref zahamowania wzrostu grzybów strzępkowychpozwalająca określić wartości minimalnych stężeń hamujących wzrostGatunki grzy-bów strzępko-wychRo-dzajbio-cyduM-1M-2M-3M-4M-5M-1M-2M-3M-4M-5M-1M-2M-3M-4M-5M-1M-2M-3M-4M-5M-1M-2M-3M-4M-5Stężenia mikrobiocydów [μl/ ml]0,8151716182015161518181517152020141412242214161424260,4131415131813121315151414131414121312171512141118200,1612911157128131381291212101210131210121012120,051111111111110,01Kon-trolaA.nigerA. ochraceusCh. globosumizolatów stanowią pleśnie z rodzajuAspergillusiPenicillium.Wymienione w tabeli 2 gatunki bardzo często występują na ma-teriałach bibliotecznych, takich jak książki, papier i pergamin, copotwierdzają wyniki uzyskane przez innych badaczy (9, 10).Do najskuteczniejszych mikrobiocydów należą te, którew swoim składzie zawierają oprócz czwartorzędowych solialkiloamoniowych również sekwestranty i poliaminy alkiloweo podwyższonym stężeniu (34 mg/g). Wśród badanych grzybówstrzępkowych najbardziej wrażliwe okazały się szczepy z rodzajuPenicillium.Z przeprowadzonych badań wynika, że przed przeprowadze-niem dezynfekcji należy określić rodzaj dominującej w danymśrodowisku mikroflory i w stosunku do niej dobrać właściwemikrobiocydy. Odpowiedni rodzaj i stężenie preparatu biobójcze-go pozwoli uniknąć pojawienia się szczepów opornych. Bardzodobra aktywność przeciwdrobnoustrojowa badanych preparatówumożliwia ich praktyczne wykorzystanie jako inhibitorów biode-terioracji papieru.Serdeczne podziękowania składamy Pani prof. dr hab. ZofiiŻakowskiej z Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologiiza cenne wskazówki i dyskusje, które pozwoliły na powstanieniniejszej pracy.Pracę tę dedykujemy naszemu Koledze Zbyszkowi Pajewskie-mu, który był łącznikiem między mikrobiologami i konserwato-rami dzieł sztuki.P terrestre.P cyclopium.Tabela 4. Wartości minimalnych stężeń mikrobiocydów (MIC, μl/ml) hamu-jących rozwój wybranych gatunków grzybów strzępkowychOznaczeniabiocydówM-1M-2M-3M-4M-5Gatunki grzybów strzępkowychA.nigerA. ochra-ceusCh. glo-bosumP terrestre.0,10,050,10,050,05P cyclo-.pium0,10,050,10,050,05LITERATURA1. Stobińska H., Zyska B.: „Papier – produkcja, wytwory papiernicze, ma-teriały w zbiorach bibliotecznych”, [w] Praca zbiorowa: „Mikrobiologiamateriałów”, red. Zyska B., Żakowska Z., Wyd. Politechniki Łódzkiej,Łódź 2005, s. 137-185.2. Gutarowska B, Cichocka A.: „Ocena zanieczyszczenia mikrobiologicznegomas papierniczych oraz wody technologicznej stosowanych w procesieprodukcji papieru”, Przegl. Papiern.65,9, 551 (2009).3. Gutarowska B., Cichocka A.: „Zastosowanie metody oznaczania ergo-sterolu do szybkiej oceny zanieczyszczenia grzybami na różnych etapachprodukcji papieru”, Przegl. Papiern.66,1, 45 (2010).4. Pinzari F., Pasquariello G, De Mico A.: “Biodeterioration of Paper: A SEMStudy of Fungal Spoilage Reproduced Under Controlled Conditions”,Macromolecular Symposia 238, 1, 57 (2006).5. Koziróg A.: „Oporność grzybów strzępkowych na N,N-bis(3-aminopropylo)dodecyloaminę”, Praca doktorska, Politechnika Łódzka 2006.6. Koziróg A., Pajewski Z., Żakowska Z., Brycki B.: „Skuteczność działaniabiocydów na grzyby strzępkowe rozwijające się na powierzchniach ma-teriałów”, Ochrona przed Korozją10s/A,50, 95-98 (2007).7. Samson R.A., Hoekstra E.S., Frisvad J.C., Filtenborg O.: “Introduction tofood and air borne fungi”, CBS Baarn, The Netherlands, 1996.8. Piotrowska M., Żakowska Z.: „Grzyby strzępkowe” [w] Praca zbiorowa:„Mikrobiologia techniczna”, red. Libudzisz Z., Żakowska Z., Kowal K.,PWN, Warszawa 2007, s. 60-83.9. Zyska B.: “Fungi Isolated from Library Materials. A Review of The Lit-erature”, International Biodeterioration and Biodegradation40,1, 43-51(1997).10. Fabbri A.A., Ricelli A., Brasini S., Fanelli C.: “Effect of Different Antifungalson the Control of Paper Biodeterioration Caused by Fungi”, InternationalBiodeterioration and Biodegradation 39, 1, 61-65 (1997).11. Block S.S. (ed) 2001. Disinfection, Sterilization, and Preservation,Lippincott Williams and Wilkins, 5th Edition, Philadelphia, USA.0,10,10,1Najskuteczniejsze w działaniu okazały się preparaty M-2, M-4i M-5. Zastosowanie ich w stężeniu 0,05 μl/ml było wystarczającedo zahamowania wzrostu szczepów z rodzajuPenicillium.Dlaosiągnięcia tego samego efektu w przypadku środków biobój-czych M-1 i M-3 wymagane jest użycie dwukrotnie większychstężeń.Najmniejszą wrażliwość na zastosowane mikrobiocydywykazywały grzybyAspergillus niger, Aspergillus ochraceusiChaetomium globosum.Dla tych gatunków wartość MIC dlawszystkich preparatów wynosiła 0,1 μl/ml. Stwierdzono, żenajskuteczniejszymi preparatami są mikrobiocydy M-4 i M-5zawierające czwartorzędowe sole alkiloamoniowe w stężeniu 150mg/g, poliaminy alkilowe w stężeniu 34 mg/g oraz sekwestranty.Powyższe preparaty w stężeniu 0,8 μl/ml powodowały pojawieniesię największych stref zahamowania wzrostu.PodsumowanieStwierdzono, że wśród zidentyfikowanych w środowisku biblio-tecznym grzybów strzępkowych występuje duża różnorodność,zarówno rodzajów, jak i gatunków, chociaż ponad 50% wszystkich52PRZEGLĄD PAPIERNICZY · 68 · STYCZEŃ 2012 [ Pobierz całość w formacie PDF ]